应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

免疫组化（IHC）等传统组织蛋白原位检测方法不适用于长链非编码RNAs（lncRNA）的可视化，但RNAscope^® RNA原位杂交技术可以在完整的形态背景下检测单细胞水平lncRNA表达。下述研究利用RNAscope^®技术检测了肿瘤组织中几个lncRNAs并分析了该其与基质细胞的关系。这项研究表明，RNAscope^®检测技术可：
· 原位检测肺癌样本中的lncRNA生物标志物；
· 精准识别lncRNAs的空间表达模式，包括肿瘤内异质性表达和肿瘤vs.间质表达；
· 鉴定lncRNAs特异性细胞类型及其亚细胞定位。

引言——lncRNAs & RNAscope

长链非编码RNAs（lncRNAs）参与许多生物学过程，包括表观遗传修饰、细胞分化和凋亡。近期研究表明，lncRNAs是一种独特的生物标志物，可能与生理或疾病状态有关，已有几种lncRNAs被认定为多种人类癌症的生物标志物1。因为其不能翻译成蛋白质，lncRNAs的发现完全依赖于RNA检测。大多数lncRNAs表达水平偏低，且与mRNA相比，表达异质性较强。因此，肿瘤组织中的lncRNAs检测要求使用高灵敏度和高特异性的方法，可以识别lncRNA在单细胞水平的其亚细胞定位。

单分子RNA原位杂交（ISH）可以在完整的形态学背景下检测到单个RNA分子，非常适用于检测肿瘤组织中lncRNAs。

为探索lncRNAs在肿瘤组织的表达模式及其所处的微环境，我们使用RNAscope^®检测技术进行RNA原位杂交。该方法是一种独特的RNA原位杂交技术，可在完整的空间与形态背景下，表征单细胞水平的基因表达。RNAscope^®检测技术采用了独特的双Z探针设计及信号放大策略，同时抑制了背景，检测新鲜冷冻、固定冷冻和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的细胞和组织中的mRNA与lncRNA，可以将目标RNA可视化为单一的信号点，一个信号点对应一个RNA分子2。RNAscope^®技术的关键优势在于基于放大策略的高灵敏度以及基于双Z探针设计的高特异性，使其在大多数组织中有很高的信噪比。

「优势看得见」用RNAscope^® 2.5HD检测试剂盒（红色）可视化人非小细胞肺癌福尔马林固定石蜡包埋组织中的lncRNAs表达。

相逢欲话

应用RNAscope^® 2.5HD检测试剂盒（红色），在56例原发性非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤组织和4例癌旁肺组织的石蜡包埋组织芯片中，检测了4种肺癌预后标志物lncRNAs（AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR和UCA1）的表达3-6，以及前列腺癌特异性标志物lncRNA PCA3的表达。

情理之中

这4种肺癌预后标志物lncRNAs在各组织样本中的表达水平存在差异，在56例NSCLC肿瘤组织中，近一半的样本组织中可以检测到上述4种lncRNAs表达，而在4例癌旁组织中并未检测到相关表达（图1；表1）。

    
图1.一系列 lncRNAs在NSCLC肿瘤组织中的表达水平。应用RNAscope^® 2.5HD检测试剂盒（红色），在60例NSCLC样本中检测5种lncRNAs（AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR、UCA1和PCA3）的表达。观察每种lncRNA的（高、中、低、无）表达水平。在本项研究中，癌旁正常组织中没有检测到任何lncRNAs表达信号。

     
表 1. RNAscope^®染色评分汇总。NSCLC肿瘤组织中特定RNAscope^®染色评分的分布。根据明视野显微镜下染色信号点的数目对染色结果进行评分：0，无染色或每10个细胞<1个染色信号点；1+，每个细胞存在1-3个信号点；2+，每个细胞存在4-10个信号点且不存在或仅存在极少的信号点聚集；3+，每个细胞存在10-15个信号点且<10%信号点聚集；4+，每个细胞存在>15个信号点且>10%信号点聚集。*阳性表达率根据在除癌旁正常组织外的所有NSCLC肿瘤组织内的RNAscope?染色评分≥1的染色信号点计算。

有趣的是，我们还观察到，PCA3在16例癌组织中呈现较低表达，而在癌旁组织中却未检测到相关表达（图1）。仅有部分研究表明肺癌组织中存在PCA3表达。RNAscope^®技术灵敏度高，即使RNA生物标志物的表达水平较低，也可以被检测出来，使研究人员可以在多种组织中检测lncRNAs的表达。此外，尽管有3种肺癌预后标志物lncRNA在68%的NSCLC肿瘤组织中可以检测到表达，这也并不表示在同一肿瘤组织内同时存在这些lncRNAs表达（图2）。

    
图2. 不同种lncRNA在同一NSCLC肿瘤组织中的表达差异。尽管有3种lncRNAs检测到在68%的NSCLC肿瘤组织中表达，但并非每个肿瘤组织都存在相同的lncRNA表达谱。（A）在组织1E5中，HOTAIR的表达水平高于AFAP1-AS1、ANRIL或UCA1。（B）在组织1F3中，AFAP1-AS1的表达水平明显高于ANRIL、HOTAIR或UCA1。（C）有部分组织也检测到这4种肺癌预后生物标记物lncRNA表达。右图为左图红色框放大内容，显示的是在同一染色区域内，连续切片在组织1D5中AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR和UCA1的染色情况。

在56例NSCLC肿瘤组织中还观察到一些有趣的lncRNA表达模式。首先，这4种肺癌lncRNA生物标志物主要表达在肿瘤细胞中，而很少甚至不在基质细胞中表达(图3)。

   
图3. 肿瘤和基质质中的lncRNA表达评估。lncRNA主要表达于肿瘤细胞，很少甚至不在基质中表达。为了证实这一点，我们使用HALO^™数字成像分析软件，对lncRNA在肿瘤中（黄色框）、基质质（绿色框）以及整个肿瘤核心区域（红色框）中的表达水平进行了量化分析。每个细胞的平均信号点代表每个区域的数量。

第二，AFAP1-AS1在多个肿瘤组织内呈现出异质性表达，包括相邻肿瘤灶存在表达或无表达，以及在肿瘤细胞之间存在表达差异（图4）。

    
图4. AFAP1-AS1在多种NSCLC肿瘤中的瘤内异质性表达。在本研究中，并非所有的肿瘤细胞均存在检测的这几种lncRNAs表达。（A）同一个NSCLC组织的邻近病灶存在不同的AFAP1-AS1表达模式。一个病灶中检测出AFAP1-AS1阳性肿瘤细胞（箭头），而另一个临近病灶却检测出AFAP1-AS1阴性肿瘤细胞（星号）。为了确保阴性病灶中RNA质量符合研究标准，我们对管家基因PPIB进行了研究，发现PPIB在两个病灶中表达一致。（B）在同一肿瘤区域内的两个NSCLC肿瘤核心区域，同时检测出AFAP1-AS1阳性肿瘤细胞（箭头）和阴性肿瘤细胞（星号）。

第三，在一些NSCLC肿瘤组织中，高表达的UCA1几乎主要位于与肿瘤相关的基质细胞中（图5）。

图5. 多种NSCLC肿瘤中UCA1在肿瘤相关基质细胞中的表达。在一些NSCLC肿瘤组织中检测UCA1表达，检测结果发现仅在肿瘤相关基质细胞的细胞亚群中存在lncRNA高表达。

最后，由于ANRIL和HOTAIR均通过表观遗传机制调节基因表达，我们采用RNAscope^®2.5 HD双通道试剂盒检测这两个lncRNAs与染色质重组因子EZH2 mRNA的共表达。在一些NSCLC肿瘤组织中，我们观察到ANRIL或HOTAIR与EZH2的共表达情况主要存在于肿瘤细胞中（图6）。

图6. lncRNA与染色质重组因子EZH2在多种NSCLC肿瘤中的共表达。用RNAscope^® 2.5 HD多通道检测试剂盒检测发现ANRIL（A）或HOTAIR（B）lncRNA（红）与EZH2 mRNA （绿）主要共表达于肿瘤细胞。

意料之外

此项研究中，应用RNAscope^®原位杂交技术，在60例NSCLC福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的肿瘤微环境中，评估几种肺癌预后生物标志物lncRNAs的表达谱。检测结果表明，该检测技术能够原位检测肺癌样本中潜在的生物标志物lncRNA，而且具有较高的灵敏度和特异性，可以有效识别组织环境中的lncRNA表达异质性和确定肿瘤组织中的lncRNA表达模式。鉴定细胞类型特异性和lncRNA表达的亚细胞定位有助于理解lncRNA在癌症和其他疾病中的特定生物学作用。

      
更多信息请访问
www.acdbio.com/lncRNA

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Reference:
1.Schmitt AM and Chang HY. Long noncoding RNAs in cancer pathways. Cancer Cell. 2017; 29: 452-463.
2.Wang F, et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 2012;14(1):22-9.
3.Deng J, et al. The up-regulation of long non-coding RNA AFAP1-AS1 is associated with the poor prognosis of NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 2015; 75:8-11.
4.Lin L, et al. Increased expression of the long non-coding RNA ANRIL promotes lung cancer cell metastasis and correlates with poor prognosis. Diagn Pathol. 2015; 10: 14.
5.Liu XH, et al. The long non-coding RNA HOTAiR indicates a poor prognosis and promotes metastasis in non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 2013; 13: 464.
6.Wang HM, et al. Upregulated IncRNA-UCA1 contributes to progression of lung cancer and is closely related to clinical diagnosis as a predictive biomarker in plasma. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(7): 11824-30.

「RNAscope技术」微课堂

RNAscope技术是由美国Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该技术优势如下：
1.应用广泛；
2.高特异性；
3.极高灵敏度，单分子可视化和单细胞定量；
4.兼容降解的RNA样本；
5.无需RNase-free操作和环境要求，一天完成实验；
6.检测结果稳定一致性，兼容高通量自动化平台；
7.多通道多靶点同时检测。