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Elispot分析：先进的细胞免疫功能研究平台在综合考虑灵敏度、易用性和成本时，Elispot平台很可能成为科研、治疗和诊断领域开发多功能T细胞分析的上乘之选，在最近方兴未艾的细胞免疫治疗方法开发中再获关注。 在体外T细胞效应功能研究中，最常用的分析包括流式细胞分析、Elispot、ELISA、多重微球芯片（又称为多因子检测或液相芯片等）和定量PCR。虽然每种分析都有着特定的优点和限制，但Elispot分析具有明显的优势：ELISpot就像基于流式细胞术的细胞内细胞因子染色（ICS），能直接确定抗原（Ag）特异的T细胞频率——而这正是免疫诊断的核心竞争力。 这样的分辨能力是上清分析所无法达到的，如ELISA或多重微球芯片，它们的测定是基于特定样品孔中所有细胞产生的大量细胞因子。在急性HIV患者中，产生IFNγ以应答共同回忆抗原（如TT或PPD）的细胞频率与健康个体相当，而斑点尺寸大大降低。这一结果表明，HIV特异的T细胞功能受到损伤，而非细胞数量减少。 同样地，与“旧的”记忆T细胞相比，最近体内激活的T细胞可能表现出每个细胞的细胞因子生产量有所增加。区分长期记忆亚群和最近激活亚群的能力对自身免疫性疾病和慢性感染的T细胞诊断很有意义。大量分析结果被先天免疫系统的背景信号所混淆。抗原特异应答的稀释导致整个信号峰变得扁平，而这个问题在检测罕见群体的存在时影响最大，例如PBMC中的循环肿瘤细胞（CTC）或骨髓中的散布肿瘤细胞，它们都是转移的早期标志物。 已知T细胞能够识别几乎无限数量的可感染物质并且同时能将它们与自身区分开来，总的初始细胞库包含≥1012种独特的T细胞受体（TCR）特异性。因此，在不存在感染时，特异识别一种抗原的循环记忆细胞的出现频率是相当低的，通常在1:10,000 -1,000,000。要检测如此罕见的细胞，对于灵敏度的下限仅为0.02%的流式平台来说完全无法胜任。 而那些以培养上清检测细胞因子的方法，如果液相芯片或ELISA，因周围环境对分析物的稀释、周围细胞的吸收以及酶的降解，其检测灵敏度会被进一步降低。相比之下，Elispot分析显示出每100万个PBMC中不到25个生产IFNγ的T细胞的检测阈值（0.0025%）；这相当于检测灵敏度提高了近10倍。Elispot分析的高灵敏度对过敏研究也很重要，其中鉴定极低频率的Th2产细胞因子细胞对疾病监控和免疫疗法的开发都很关键。特别是在流式细胞仪和ELISA平台上都已证实不足以检测的IL-4，而这正是Th2驱动应答的主要指标。 Elispot分析的开发始于1983年，是以平板为基础的酶联免疫吸附分析（ELISA）和以膜为基础的Western blotting技术的融合，可实现在单细胞水平检测分泌的分析对象。与标准的聚苯乙烯表面相比，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜大大改善了抗体结合特性，更强的结合膜表面具有更高的Ab密度，带来更明确的斑点。微孔板形式则进一步提高了操作通量，也容易实现自动化；更多样品，更多刺激条件，或更多不同的细胞因子可在相邻孔中同时平行。Elispot是可实现对单细胞进行生物学功能（如细胞因子的释放）定量分析的少数几种技术之一。  流式细胞仪刚刚启动时会有不少样品损失，与之不同，Elispot中的每个细胞都会被测定。Elispot 需要的细胞数仅为流式分析的十分之一，这对于那些珍贵的（如远程取样）和/ 或有限的（如细胞治疗病人，小儿或免疫抑制检测的受试者）的样品至关重要。96孔板一直存在一个问题，即小规模分析中浪费了未使用的孔，比如单个患者样品的诊断分析。默克生命科学特别提供了8联管（目录号M8ips4510），这种联管是透明的，适合FluoroSpot应用，以及标准的酶学分析，表现与标准96孔板相当。  ELISpot技术极为灵敏，但对操作经验有一定的要求。在此，默克生命科学基于开发这个技术所积累的经验，为您用好这个免疫细胞检测的绝佳技术平台提供非常有用的Tips，助您获得精确而有意义的数据。 |