蛋白质的泛素化由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3共同参与完成。目前已知的E1有两种：Uba1和Uba6。西北大学的研究人员利用正交泛素转移技术（orthogonal ubiquitin transfer technology，OUT）结合质谱分析成功鉴定到了Uba1和Uba6的底物。该成果近日发表在的Nature communication上。景杰生物作为全球蛋白质与修饰领域的领跑者，可以为您提供完善的泛素化研究的解决方案，从高灵敏度的泛素化抗体到高通量泛素化修饰组学，为您的研究助一臂之力。
泛素（ubiquitin，UB）分子共价结合到胞内蛋白上，进而调控该蛋白的命运，例如调控蛋白降解、改变亚细胞结构定位、调节酶的活性等等。这一过程中，UB首先被E1激活，在UB的活性半胱氨酸位点与羧基端形成硫酯键。随后E2结合UB并由E3将UB连接到目标蛋白上。起初人们认为Uba1是单一的E1，后研究发现Uba6也是一种可替代或者说非典型的E1，这两种E1在很大程度上具有重叠性，是可交互使用。后来的研究表明，Uba6在胚胎发育、神经系统发育及功能、代谢活动等过程中发挥着重要的作用。到目前为止，只有少数蛋白如RGS4、RGS5、Shank3等依赖于Uba6激活其泛素化，但Uba6如何起始泛素化的过程仍然未知。为了更好的研究Uba6在泛素化中扮演的角色，西北大学的研究人员采用正交泛素转移试验，以区分胞内Uba1与Uba6的泛素化目标蛋白。
研究策略：改造UB 使得突变型UB（xUB）不能被野生型Uba1或Uba6激活，同时改造Uba1和Uba6上UB的结合位点，使得突变型Uba1（xUba1）和Uba6（xUba6）恢复对xUB的激活能力并且丧失对野生型UB的激活能力。由此，xUB可以通过xUba1或xUba6激活并传递给E2、E3以及下游目标蛋白。在表达带FLAG标签的xUba1或xUba6细胞株中分别表达带HBT标签的xUB，使用Ni-NTA树脂及streptavidin-agarose纯化xUB连接的蛋白，随后采用质谱鉴定，筛选出Uba1或Uba6可能的激活底物。
结果部分：体外实验表明，该研究体系中改造过后的xUB-xUba1/ xUB-xUba6的功能接近于wtUB-wtUba1/ wtUB-wtUba6，并且可以转移给wtUBE2D2/UbcH5b（E2）。利用慢病毒载体表达带HBT标签的xUB及wtUB，并感染HEK293细胞。实验证明在HEK293细胞内xUB-xE1与UB-E1一样具有良好的正交性。下一步纯化HBT-xUB连接的胞内蛋白并用质谱检测。在表达xUba6的细胞中鉴定出与xUB相连的蛋白有697个，在表达xUba1的细胞中鉴定出与xUB相连的蛋白有527个，其中有258个蛋白可能为xUba1与xUba6共同的底物，与之前的假设——Uba1与Uba6功能上存在重叠相一致。进一步生物信息学分析显示线粒体功能障碍、Cdc42信号传递与RhoA信号传递可能只与Uba6的底物相关，而氧化胁迫、AMPK信号传递可能只与Uba1有关。随后研究人员选取了ezrin、RNA结合蛋白CUGBP1等进行生化实验验证，结果表明ezrin与RNA结合蛋白CUGBP1确实为Uba6的底物，调节其发生K48位的多聚泛素化，从而被蛋白酶体降解。
由于ezrin控制上皮细胞形态发生的基底部极性，研究人员推测Uba6引起的泛素化是否与上皮细胞腺泡的形态发生有关。MCF-10A细胞在富含层粘连蛋白基膜如Matrigel上培养时可以分化形成高度组织化的acini-like球状结构。这一体系被广泛用于研究上皮腺泡形成中各基因的功能。在MCF-10A细胞中敲除uba6以及敲除uba6并回补uba6，结果发现敲除uba6上皮细胞腺泡显著增大，并且接近30%的细胞不能形成典型的内腔结构。免疫荧光显微镜下观察可以看到，对照组细胞中ezrin在质膜上显著富集，而在uba6敲除细胞中ezrin分布较弥散。而uba6回补后能显著回复细胞的表型例如增大的球状体、ezrin亚细胞结构分布散乱等，显示Uba6对上皮细胞acini-like的形态发生具有重要的调控作用。
这项研究采用正交泛素转移技术，首次描述并且区分了两种E1——Uba1和Uba6的靶标蛋白以及相关的细胞信号传递途径，Uba1和Uba6的底物存在一定程度的交叉又各有其特异性，可能起始不同的E1-E2-E3途径从而影响特定蛋白的泛素化。同时，研究人员认为，这种正交泛素转移技术可以被进一步拓展，用于鉴定E2和E3的特异性底物，更大程度上揭示E1-E2-E3在调节不同细胞功能上发挥的作用。
参考文献：
Liu X, Zhao B, Sun L, et al. Orthogonal ubiquitin transfer identifies ubiquitination substrates under differential control by the two ubiquitin activating enzyme.Nature Communications, 2017, 8: 14286.
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